红藻藻蓝蛋白对HL-60细胞生长的抑制作用
作者：刘宇峰 徐力致 张成武 魏海燕 李恒
单位：刘宇峰 徐力致 魏海燕 李恒(南京大学医学院，南京 210093)；张成武(南京化工大学生物工程与技术系)
关键词：红藻藻蓝蛋白；HL-60；半固体琼脂培养法；MTT法；流式细胞仪；免疫印渍法
中国海洋药物000107 摘 要：本文运用半固体琼脂培养法及MTT法研究了红藻藻蓝蛋白(R-PC)对HL-60细胞生长的影响，结果发现：R-PC能够显著抑制细胞的生长，且存在浓度效应和时间效应关系。为进一步探索R-PC抑制HL-60细胞生长的可能机制,将不同浓度的R-PC与HL-60细胞相互作用6d后，分别用流式细胞仪检测HL-60细胞所处细胞周期中的时相和免疫印渍法测定HL-60细胞中Bcl-2基因表达产物的变化，实验结果显示：R-PC确能使更多的HL-60细胞滞留于细胞周期的G0-G1期，但与R-PC浓度无正向关系，且HL-60细胞中Bcl-2基因表达产物的量也没有明显的变化。结果表明：R-PC可能通过不同于G0-G1期滞留及Bcl-2基因表达的机制抑制HL-60细胞的生长。
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THE INHIBITION OF PHYCICYANIN FROM PORPHYRA HAITANENSIS ON THE GROWTH OF HUMAN LEUKEMIA HL-60 CELLS
liu Yufeng Xu Lizhi Zhang Chengwu Wei Haiyan Li Heng
(Medical School of Nanjing University, Nanjing 210093)
ABSTRACT：The effect of phycocyanin from Porphyra haitanensis on the growth of human leukemia HL-60 cells was studied by semi-solid culture method and MTT staining assay. The results showed that the phycocyanin could significantly inhibit the growth of HL-60 cells in a dose- an time-dependent manner. In order to elucidate the potential pathway of the phycocyanin affecting the growth of HL-60 cells treated with phycocyanin at different concentrations for 6 days were further checked by flow cytometric assay and western blot analysis. Flow cytometric assay demonstrated that more HL-60 cells underwent G0-G1 arrest,but there were not evident differences between the experimental groups and the control. Western bolt analysis indicated that the expression level of Bcl-2 protein remained unchanged.These findings suggested that the phycocyanin could inhibit the growth of HL-60 cells by the potential pathways other than G0-G1 arrested or the expression change of Bcl-2 protein.
, 百拇医药
KEY WORDS：Phycocyanin from Porphyra Haitanensis, HL-60 cells Semi-solid agar, MTT staining assay, Flowcytometric assay, Westem Blot analysis.▲
随着科学技术的发展，开始掀起了研究海洋活性物质，尤其是海藻的热潮[1]。有研究表明：海洋生物的提取物，如藻类多糖、多肽和藻蓝蛋白能够影响肿瘤细胞的增殖[2，3]。藻蓝蛋白是某些藻类特有的捕光色素蛋白，因其具有能溶于水和化学性质稳定等特点，因而在免疫检测、荧光显微技术和流式细胞仪技术方面，是一种很好的生化示踪物[4]。有实验证明，藻蓝蛋白具有某些抗肿瘤活性[5]，对癌激光治疗有增敏作用[6]，并对小鼠粒单系祖细胞具促进生长的作用[7]。
本实验所用红藻藻蓝蛋白(R-PC)，来源于坛紫菜(Porhyra haitanensis),其最大吸收峰为558nm和617nm，λFmax为635nm，其分子量为117000，等电点为4.62。为了研究红藻藻蓝蓝白对肿瘤细胞生长的影响，更深入了解R-PC的理化性质，探索其成为肿瘤抑制物的可能性，本文研究了R-PC对HL-60细胞生长的影响。
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1 材料和方法：
1.1 材料
1.1.1 R-PC：南京化工大学生物工程与技术系张成武提供。
1.1.2 RPMI 1640和MTT分别为美国Gibco和Sigma公司产品。
1.1.3 小牛血清：杭州四季青生物材料研究所产品。
1.1.4 抗Bcl-2蛋白单克隆抗体：上海华美公司产品。
1.1.5 HL-60细胞：购于中科院上海细胞所细胞库。
1.2 实验方法
1.2.1 HL-60细胞的培养：用含10%小牛血清的RPMI完全培养液培养HL-60细胞至对数生长期，计数后分别进行下列检测。
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1.2.2 半固体琼脂培养法[8]：下层琼脂浓度为0.5%，其中含16%RPMI 1640(4X)和20%小牛血清。上层琼脂浓度为0.3%，其中除含与下层琼脂相同的RPMI 1640和小牛血清外，还含HL-60细胞(4×103/ml)及R-PC(40μg/ml,80μg/ml,160μg/ml3个浓度组，每个浓度组12d相同样本)，正常对照则不加R-PC。置37℃，5%CO2浓度条件下培养4、6、8、10、12天进行集落计数(大于20个细胞的细胞团为一个集落)。
1.2.3 MTT检测法[9]：用RPMI 1640完全培养液将HL-60细胞稀释至2×104/ml，分别于24孔培养板中每孔加细胞悬液1ml，并加入相应的R-PC使其最终浓度分别为40μg/ml,80μg/ml和160μg/ml,每个浓度设6个相同样本，对照组则不如R-PC，置CO2培养箱中培养至2、4、6、8、10天，从每孔吸取100μl细胞悬液，进行MTT检测，并于波长570nm处测OD值。
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1.2.4 流式细胞仪检测(由南京铁道医学院分析细胞室检测)：将HL-60细胞分别培养于3种浓度的R-PC(40μg/ml,80μg/ml和160μg/ml)的RPMI 1640完全培养液中培养6d，收集HL-60细胞，用冷的PBS洗3次，用70%酒精固定。临检测前用PBS洗2次，分别加Tritun-α-100 1ml，静置4℃ 10min，离心去上清，加1ml 0.01%RNA酶静置10min，离心去上清，加1ml0.005%PI(碘化丙啶)，300目尼龙网过滤，置4℃冰箱15min后，用FACS Calibur(美国B.D公司)流式细胞仪检测，并用Cell Quest 软件收集，用Modfit 软件分析HL-60细胞所处于细胞周期中时相。
1.2.5 免疫印渍法检测Bcl-2基因表达产物的变化[10]：将HL-60细胞分别培养于3种浓度的R-PC(40μg/ml,80μg/ml和160μg/ml)的RPMI 1640完全培养液中培养6d，收集HL-60细胞，用冷的PBS洗3次，水浴条件下用裂解缓冲液裂解HL-60细胞，离心，测定上清中的蛋白浓度。经12%的SDS-PAGE电泳并转移到硝酸纤维膜上。该硝酸纤维膜经5%脱脂奶粉封闭后，分别与一抗(鼠抗Bcl-2单克隆抗体)和二抗(HRP标记的羊抗鼠IgG抗体)反应，最后用DAB显色并观察实验结果。
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2 实验结果
2.1 R-PC对HL-60细胞集落形成的影响：表1结果显示，与对照组相比，实验组3在培养至第4、6、8、10、12d都存在非常显著的差异,实验组1、2在第6d及第12d与对照组间也分别存在显著的差别。
表1 R-PC对HL-60细胞集落形成的影响 培养天数
4
6
8
10
12
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R
｜
PC
浓
度
对照组
给药组
(μg/mg)
40
80
160
3.1±0.74
2.9±0.74
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2.6±0.70
1.9±0.56**
3.8±0.63
3.0±0.82*
2.7±0.67**
2.0±0.47**
4.2±0.63
3.4±0.84
3.2±0.92
3.1±0.74**
4.5±0.97
4.2±0.79
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4.0±0.67
3.1±0.74**
4.7±0.95
3.7±0.67*
3.0±0.82**
3.2±0.79**
F-检验，*P<0.05,vs control;**P<0.01,vs control(n=10)
2.2 R-PC对HL-60细胞MTT OD值的影响：表2显示：与对照组相比，实验组3在第2、4、6、8、10d都存在非常显著的差异；实验组2在第2d存在显著的差异,在第4、6、8、10d都存在非常显著的差异;实验组1则在第4、6、8d都存在非常显著的差异,在第10d存在显著的差异。将表2结果与表1相比较，R-PC浓度为160μg/ml时对HL-60细胞的生长抑制结果非常一致,其余两种浓度下在不同的作用时间下的结果有些差异,但都说明了R-PC对HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用。
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表2 R-PC对HL-60细胞MTTOD值的影响。 培养天数
4
6
8
10
12
R
｜
PC
浓
度
对照组
给药组
, 百拇医药
(μg/mg)
40
80
160
0.02±0.025
0.18±0.022
0.17±0.014*
0.14±0.021**
0.40±0.029
0.26±0.042**
0.30±0.035**
0.25±0.046**
, 百拇医药
0.61±0.056
0.53±0.065**
0.52±0.014**
0.34±0.035**
0.88±0.072
0.38±0.049**
0.36±0.035**
0.31±0.042
0.56±0.049
0.49±0.028*
0.38±0.028**
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0.29±0.023**
F-检验，*P<0.05,vs control;**P<0.01,vs control(n=10)
2.3 流式细胞仪检测：R-PC与HL-60细胞共同培养6d后，与对照组相比，HL-60细胞处于细胞周期G0-G1期的百分率都有不同程度的增加，而处于S期的HL-60细胞则相应减少，并且这种时相的变化与R-PC的浓度成一定的反向效应(表3)。可能是HL-60细胞本身的缘故或处于G2/M期的HL-60细胞较少的原因，在分析过程中，处于这时期的HL-60细胞被忽略了，因而没能测出这部分处于G2/M时相的细胞。表3 R-PC对HL-60细胞处于细胞周期时相的影响 时相
G0-G1期(%)
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S期(%)
组
别
对照组
给药组
(μg/ml)
40
80
160
31.66
34.86
33.37
32.52
, 百拇医药
68.34
65.14
66.63
67.48
2.4 免疫印渍法检测：R-PC与HL-60细胞共同培养6天后，与对照组相比较，实验组Bcl-2基因表达产物量没有明显差异,且实验组之间，HL-60细胞的Bcl-2基因表达量也没有明显变化。
3 讨论
随着海洋生物药物研究的深入，已发现了许多诸如海藻海洋生物体内存在多种抗肿瘤的生化活性物质[11]。藻蓝蛋白作为藻类家族中的重要成员，在某些藻类中含量极为丰富，是一种完全无毒的蛋白质资源[12]。因藻蓝蛋白对一些肿瘤细胞的生长具抑制作用或辅助杀伤作用[5，6]，因而其重要性已日益为人们所重视。从表1和表2可知：R-PC在160μg/ml浓度下对HL-60细胞的集落形成及MMT OD值存在非常显著的抑制作用，在40和80两种浓度下，都在第6d和第12d对HL-60细胞的集落形成有显著或非常显著的抑制作用，对HL-60细胞MTT OD值都有显著或十分显著的影响。这些结果都表明：R-PC对HL-60细胞的生长有明显的抑制作用。
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为了进一步探索R-PC抑制HL-60细胞生长的可能机制,将HL-60细胞与R-PC共同培养6d后，用流式细胞仪和免疫印渍法分别检测了HL-60细胞所处于细胞周期中的时相及HL-60细胞中的Bcl-2基因表达产物的变化情况。表3-表明：在R-PC作用6d后，处于G0-G1期的HL-60细胞的百分率较对组略有增加，其相应处于S期的HL-60细胞数则相应减少。滞留于细胞周期G0-G1期HL-60细胞增多，可能会使部分HL-60细胞因进行增殖。但HL-60细胞滞留于G0-G1期的数量增多并没有与R-PC的浓度呈现正相关性。由于滞留于G0-G1期的细胞增多可能与细胞发生程序性相关[13]，经流式细胞仪检测，R-PC与HL-60细胞作用6d后，确有极少部分HL-60细胞发生了程序性死亡，但与R-PC的浓度无相关性，且经琼脂糖电泳检测，也没见到典型的梯形条带出现。这些结果说明抑制HL-60细胞增殖可能不是通过程序性死亡这一机制实现的。
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由于Bcl-2基因能够拮抗多种试剂引发的细胞死亡[14]，我们在实验中用免疫印渍法检测了经R-PC作用6d后的HL-60细胞的Bcl-2基因表达产物的变化情况。结果表明：HL-60细胞中的Bcl-2基因的表达与有无R-PC作用无明显相关性，说明R-PC也没有引发Bcl-2基因表达，Bcl-2基因表达产物的变化可能与R-PC对HL-60细胞的抑制作用无直接相关性。
至于R-PC主要通过何种机制来抑制的生长，目前还不清楚。已有报道：藻蓝蛋白能显著减轻辐射对小鼠外周血细胞和骨髓细胞的损伤，加速外周血白细胞和骨髓有形细胞的恢复[12]。藻蓝蛋白可能作为一种DNA稳定因子起作用[15]，与藻蓝蛋白同属藻类重要成分的多糖，主要是通过抑制NDA合成的机制来抑制肿瘤细胞生长[16]。R-PC抑制HL-60细胞的生长，是否是通过影响合成DNA和RNA的机制,或以诱导HL-60细胞内信息分子的改变来实现的，还需进一步研究。
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参考文献：
[1]Sadanori mizukoshi et al.Effect of seaweed preprations of marine immunocytes. J of applied phycology, 1993,5:629
[2]Liao huinan et al.Deveopment of the antitumor active substances from marine organisms. Development of biology and engineering. 1995,15(1):8
[3]刘宇峰.极大螺旋藻胞外多糖对血癌细胞的影响，中草药.1999，30(2)：115
[4]张成武.藻胆蛋白的开发和利用，中国海洋药物.1995，3：52
, http://www.100md.com
[5]Dainippon Ink & Chemicals (DIC)(1983)Antitumoral agents containing phycobillin. Japanese patient #58-65216,N.Iijima,N.Fuji & Shimamatsu; Assignees:Daippon Ink & Tokyo Stress Foundation, Apr.18,6pp
[6]蔡心涵.螺旋藻藻蓝蛋白对癌激光治疗法增敏作用的实验研究.中国海洋药物，1995，1：15
[7]张成武.藻蓝蛋白对小鼠粒单系祖细胞生成的影响.中国海洋药物，1996，15(4)：25
[8]福德.现代医学实验技术全书，北医大、协和医科大学联合出版社：1995，446
[9]李登华.MTT方法测试药物对悬浮肿瘤细胞的细胞毒性研究.癌症，1991，10(3)：226
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[10]Minyue Zhang et al.Effect of amidinopiperidine-4-carboxylic acid 4-tert-butylphenyl ester,a specific trypsin inhibitor, on the growth of HL-60 cells. Biochemistry and molecuular biology international1998，45(2):363
[11]缪辉南.海洋生物抗肿瘤活性物质的研究进展.生物工程进展，1995，15(1)：8
[12]张成武.钝顶螺旋藻藻胆蛋白的分离、纯化及其理化特性.天然产物研究与开发，1996，8(2)：29
[13]Shih Tzung Chang et al.Potrntiation of sodium butyrate-induced apoptosis by vanadate in human promyelocytic leukmia cell line HL-60. Biochemical and biophysical research communications.1996，221:594
, 百拇医药
[14]Kuo ML et al.Bcl-2 prebents toposiomerase II inhibitor GL331-induced apoptosis is mediated by down-regulation of poly (ADP-ribose) polymerase gctivity. Oncogene 1998，17(17):2225
[15]Qishen P et al.Radioprotective effect from Shirulina Platensis bone marrow cells studied by using the micronucleus test. Toxicology lett. 1989,48:165
[16]刘力生.螺旋藻多糖对移植性癌细胞的抑制作用及其机理的研究.海洋科学，1991，5：33, 百拇医药
单位：刘宇峰 徐力致 魏海燕 李恒(南京大学医学院，南京 210093)；张成武(南京化工大学生物工程与技术系)
关键词：红藻藻蓝蛋白；HL-60；半固体琼脂培养法；MTT法；流式细胞仪；免疫印渍法
中国海洋药物000107 摘 要：本文运用半固体琼脂培养法及MTT法研究了红藻藻蓝蛋白(R-PC)对HL-60细胞生长的影响，结果发现：R-PC能够显著抑制细胞的生长，且存在浓度效应和时间效应关系。为进一步探索R-PC抑制HL-60细胞生长的可能机制,将不同浓度的R-PC与HL-60细胞相互作用6d后，分别用流式细胞仪检测HL-60细胞所处细胞周期中的时相和免疫印渍法测定HL-60细胞中Bcl-2基因表达产物的变化，实验结果显示：R-PC确能使更多的HL-60细胞滞留于细胞周期的G0-G1期，但与R-PC浓度无正向关系，且HL-60细胞中Bcl-2基因表达产物的量也没有明显的变化。结果表明：R-PC可能通过不同于G0-G1期滞留及Bcl-2基因表达的机制抑制HL-60细胞的生长。
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THE INHIBITION OF PHYCICYANIN FROM PORPHYRA HAITANENSIS ON THE GROWTH OF HUMAN LEUKEMIA HL-60 CELLS
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ABSTRACT：The effect of phycocyanin from Porphyra haitanensis on the growth of human leukemia HL-60 cells was studied by semi-solid culture method and MTT staining assay. The results showed that the phycocyanin could significantly inhibit the growth of HL-60 cells in a dose- an time-dependent manner. In order to elucidate the potential pathway of the phycocyanin affecting the growth of HL-60 cells treated with phycocyanin at different concentrations for 6 days were further checked by flow cytometric assay and western blot analysis. Flow cytometric assay demonstrated that more HL-60 cells underwent G0-G1 arrest,but there were not evident differences between the experimental groups and the control. Western bolt analysis indicated that the expression level of Bcl-2 protein remained unchanged.These findings suggested that the phycocyanin could inhibit the growth of HL-60 cells by the potential pathways other than G0-G1 arrested or the expression change of Bcl-2 protein.
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KEY WORDS：Phycocyanin from Porphyra Haitanensis, HL-60 cells Semi-solid agar, MTT staining assay, Flowcytometric assay, Westem Blot analysis.▲
随着科学技术的发展，开始掀起了研究海洋活性物质，尤其是海藻的热潮[1]。有研究表明：海洋生物的提取物，如藻类多糖、多肽和藻蓝蛋白能够影响肿瘤细胞的增殖[2，3]。藻蓝蛋白是某些藻类特有的捕光色素蛋白，因其具有能溶于水和化学性质稳定等特点，因而在免疫检测、荧光显微技术和流式细胞仪技术方面，是一种很好的生化示踪物[4]。有实验证明，藻蓝蛋白具有某些抗肿瘤活性[5]，对癌激光治疗有增敏作用[6]，并对小鼠粒单系祖细胞具促进生长的作用[7]。
本实验所用红藻藻蓝蛋白(R-PC)，来源于坛紫菜(Porhyra haitanensis),其最大吸收峰为558nm和617nm，λFmax为635nm，其分子量为117000，等电点为4.62。为了研究红藻藻蓝蓝白对肿瘤细胞生长的影响，更深入了解R-PC的理化性质，探索其成为肿瘤抑制物的可能性，本文研究了R-PC对HL-60细胞生长的影响。
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1 材料和方法：
1.1 材料
1.1.1 R-PC：南京化工大学生物工程与技术系张成武提供。
1.1.2 RPMI 1640和MTT分别为美国Gibco和Sigma公司产品。
1.1.3 小牛血清：杭州四季青生物材料研究所产品。
1.1.4 抗Bcl-2蛋白单克隆抗体：上海华美公司产品。
1.1.5 HL-60细胞：购于中科院上海细胞所细胞库。
1.2 实验方法
1.2.1 HL-60细胞的培养：用含10%小牛血清的RPMI完全培养液培养HL-60细胞至对数生长期，计数后分别进行下列检测。
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1.2.2 半固体琼脂培养法[8]：下层琼脂浓度为0.5%，其中含16%RPMI 1640(4X)和20%小牛血清。上层琼脂浓度为0.3%，其中除含与下层琼脂相同的RPMI 1640和小牛血清外，还含HL-60细胞(4×103/ml)及R-PC(40μg/ml,80μg/ml,160μg/ml3个浓度组，每个浓度组12d相同样本)，正常对照则不加R-PC。置37℃，5%CO2浓度条件下培养4、6、8、10、12天进行集落计数(大于20个细胞的细胞团为一个集落)。
1.2.3 MTT检测法[9]：用RPMI 1640完全培养液将HL-60细胞稀释至2×104/ml，分别于24孔培养板中每孔加细胞悬液1ml，并加入相应的R-PC使其最终浓度分别为40μg/ml,80μg/ml和160μg/ml,每个浓度设6个相同样本，对照组则不如R-PC，置CO2培养箱中培养至2、4、6、8、10天，从每孔吸取100μl细胞悬液，进行MTT检测，并于波长570nm处测OD值。
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1.2.4 流式细胞仪检测(由南京铁道医学院分析细胞室检测)：将HL-60细胞分别培养于3种浓度的R-PC(40μg/ml,80μg/ml和160μg/ml)的RPMI 1640完全培养液中培养6d，收集HL-60细胞，用冷的PBS洗3次，用70%酒精固定。临检测前用PBS洗2次，分别加Tritun-α-100 1ml，静置4℃ 10min，离心去上清，加1ml 0.01%RNA酶静置10min，离心去上清，加1ml0.005%PI(碘化丙啶)，300目尼龙网过滤，置4℃冰箱15min后，用FACS Calibur(美国B.D公司)流式细胞仪检测，并用Cell Quest 软件收集，用Modfit 软件分析HL-60细胞所处于细胞周期中时相。
1.2.5 免疫印渍法检测Bcl-2基因表达产物的变化[10]：将HL-60细胞分别培养于3种浓度的R-PC(40μg/ml,80μg/ml和160μg/ml)的RPMI 1640完全培养液中培养6d，收集HL-60细胞，用冷的PBS洗3次，水浴条件下用裂解缓冲液裂解HL-60细胞，离心，测定上清中的蛋白浓度。经12%的SDS-PAGE电泳并转移到硝酸纤维膜上。该硝酸纤维膜经5%脱脂奶粉封闭后，分别与一抗(鼠抗Bcl-2单克隆抗体)和二抗(HRP标记的羊抗鼠IgG抗体)反应，最后用DAB显色并观察实验结果。
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2 实验结果
2.1 R-PC对HL-60细胞集落形成的影响：表1结果显示，与对照组相比，实验组3在培养至第4、6、8、10、12d都存在非常显著的差异,实验组1、2在第6d及第12d与对照组间也分别存在显著的差别。
表1 R-PC对HL-60细胞集落形成的影响 培养天数
4
6
8
10
12
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R
｜
PC
浓
度
对照组
给药组
(μg/mg)
40
80
160
3.1±0.74
2.9±0.74
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2.6±0.70
1.9±0.56**
3.8±0.63
3.0±0.82*
2.7±0.67**
2.0±0.47**
4.2±0.63
3.4±0.84
3.2±0.92
3.1±0.74**
4.5±0.97
4.2±0.79
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4.0±0.67
3.1±0.74**
4.7±0.95
3.7±0.67*
3.0±0.82**
3.2±0.79**
F-检验，*P<0.05,vs control;**P<0.01,vs control(n=10)
2.2 R-PC对HL-60细胞MTT OD值的影响：表2显示：与对照组相比，实验组3在第2、4、6、8、10d都存在非常显著的差异；实验组2在第2d存在显著的差异,在第4、6、8、10d都存在非常显著的差异;实验组1则在第4、6、8d都存在非常显著的差异,在第10d存在显著的差异。将表2结果与表1相比较，R-PC浓度为160μg/ml时对HL-60细胞的生长抑制结果非常一致,其余两种浓度下在不同的作用时间下的结果有些差异,但都说明了R-PC对HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用。
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表2 R-PC对HL-60细胞MTTOD值的影响。 培养天数
4
6
8
10
12
R
｜
PC
浓
度
对照组
给药组
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(μg/mg)
40
80
160
0.02±0.025
0.18±0.022
0.17±0.014*
0.14±0.021**
0.40±0.029
0.26±0.042**
0.30±0.035**
0.25±0.046**
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0.61±0.056
0.53±0.065**
0.52±0.014**
0.34±0.035**
0.88±0.072
0.38±0.049**
0.36±0.035**
0.31±0.042
0.56±0.049
0.49±0.028*
0.38±0.028**
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0.29±0.023**
F-检验，*P<0.05,vs control;**P<0.01,vs control(n=10)
2.3 流式细胞仪检测：R-PC与HL-60细胞共同培养6d后，与对照组相比，HL-60细胞处于细胞周期G0-G1期的百分率都有不同程度的增加，而处于S期的HL-60细胞则相应减少，并且这种时相的变化与R-PC的浓度成一定的反向效应(表3)。可能是HL-60细胞本身的缘故或处于G2/M期的HL-60细胞较少的原因，在分析过程中，处于这时期的HL-60细胞被忽略了，因而没能测出这部分处于G2/M时相的细胞。表3 R-PC对HL-60细胞处于细胞周期时相的影响 时相
G0-G1期(%)
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S期(%)
组
别
对照组
给药组
(μg/ml)
40
80
160
31.66
34.86
33.37
32.52
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68.34
65.14
66.63
67.48
2.4 免疫印渍法检测：R-PC与HL-60细胞共同培养6天后，与对照组相比较，实验组Bcl-2基因表达产物量没有明显差异,且实验组之间，HL-60细胞的Bcl-2基因表达量也没有明显变化。
3 讨论
随着海洋生物药物研究的深入，已发现了许多诸如海藻海洋生物体内存在多种抗肿瘤的生化活性物质[11]。藻蓝蛋白作为藻类家族中的重要成员，在某些藻类中含量极为丰富，是一种完全无毒的蛋白质资源[12]。因藻蓝蛋白对一些肿瘤细胞的生长具抑制作用或辅助杀伤作用[5，6]，因而其重要性已日益为人们所重视。从表1和表2可知：R-PC在160μg/ml浓度下对HL-60细胞的集落形成及MMT OD值存在非常显著的抑制作用，在40和80两种浓度下，都在第6d和第12d对HL-60细胞的集落形成有显著或非常显著的抑制作用，对HL-60细胞MTT OD值都有显著或十分显著的影响。这些结果都表明：R-PC对HL-60细胞的生长有明显的抑制作用。
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为了进一步探索R-PC抑制HL-60细胞生长的可能机制,将HL-60细胞与R-PC共同培养6d后，用流式细胞仪和免疫印渍法分别检测了HL-60细胞所处于细胞周期中的时相及HL-60细胞中的Bcl-2基因表达产物的变化情况。表3-表明：在R-PC作用6d后，处于G0-G1期的HL-60细胞的百分率较对组略有增加，其相应处于S期的HL-60细胞数则相应减少。滞留于细胞周期G0-G1期HL-60细胞增多，可能会使部分HL-60细胞因进行增殖。但HL-60细胞滞留于G0-G1期的数量增多并没有与R-PC的浓度呈现正相关性。由于滞留于G0-G1期的细胞增多可能与细胞发生程序性相关[13]，经流式细胞仪检测，R-PC与HL-60细胞作用6d后，确有极少部分HL-60细胞发生了程序性死亡，但与R-PC的浓度无相关性，且经琼脂糖电泳检测，也没见到典型的梯形条带出现。这些结果说明抑制HL-60细胞增殖可能不是通过程序性死亡这一机制实现的。
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由于Bcl-2基因能够拮抗多种试剂引发的细胞死亡[14]，我们在实验中用免疫印渍法检测了经R-PC作用6d后的HL-60细胞的Bcl-2基因表达产物的变化情况。结果表明：HL-60细胞中的Bcl-2基因的表达与有无R-PC作用无明显相关性，说明R-PC也没有引发Bcl-2基因表达，Bcl-2基因表达产物的变化可能与R-PC对HL-60细胞的抑制作用无直接相关性。
至于R-PC主要通过何种机制来抑制的生长，目前还不清楚。已有报道：藻蓝蛋白能显著减轻辐射对小鼠外周血细胞和骨髓细胞的损伤，加速外周血白细胞和骨髓有形细胞的恢复[12]。藻蓝蛋白可能作为一种DNA稳定因子起作用[15]，与藻蓝蛋白同属藻类重要成分的多糖，主要是通过抑制NDA合成的机制来抑制肿瘤细胞生长[16]。R-PC抑制HL-60细胞的生长，是否是通过影响合成DNA和RNA的机制,或以诱导HL-60细胞内信息分子的改变来实现的，还需进一步研究。
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